化學(xué)發(fā)光染液工作原理：以常用于免疫印跡（Western Blot）實驗的增強化學(xué)發(fā)光（ECL）染液為例，其核心反應(yīng)體系圍繞辣根過氧化物酶（HRP）和魯米諾構(gòu)建。在檢測過程中，首先 HRP 標(biāo)記的抗體與膜上的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，形成抗原 - 抗體 - HRP 復(fù)合物。隨后加入含有魯米諾和過氧化氫的 ECL 工作液，在 HRP 的催化作用下，過氧化氫分解產(chǎn)生氧自由基。氧自由基具有強氧化性，會將魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸。處于激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸不穩(wěn)定，當(dāng)它回到基態(tài)時，會以光的形式釋放多余能量，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。該信號的強度與目標(biāo)蛋白的含量相關(guān)，通過檢測發(fā)光信號的強度和位置，即可確定目標(biāo)蛋白的存在和含量。為了進一步提高檢測靈敏度，一些 ECL 發(fā)光染液中還添加了特殊的增強劑，這些增強劑能夠與反應(yīng)中間產(chǎn)物結(jié)合，穩(wěn)定激發(fā)態(tài)分子，減少能量損失，顯著增強發(fā)光信號并延長發(fā)光時間，使檢測靈敏度可達到飛克（fg，10?1?g）級別，能夠檢測到極低含量的目標(biāo)蛋白 。

熒光發(fā)光染液工作原理：熒光蛋白發(fā)光染液利用了熒光染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后在特定波長光激發(fā)下發(fā)出熒光的特性。以 DyLight 系列熒光染料為例，這類染料具有良好的水溶性、pH 不敏感性、高亮度、光穩(wěn)定性以及較長的圖像采集時間等優(yōu)點。其與蛋白質(zhì)的結(jié)合主要通過與蛋白質(zhì)的氨基或巰基等活性基團發(fā)生共價結(jié)合，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的標(biāo)記。當(dāng)被標(biāo)記的蛋白質(zhì)受到合適的激發(fā)光照射時，熒光染料分子吸收光子能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，電子會迅速從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，在此過程中以光的形式釋放能量，發(fā)出特定波長的熒光?？蒲腥藛T通過熒光成像設(shè)備檢測熒光信號的強度和分布，從而對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜，這使得科研人員可以根據(jù)實驗需求選擇合適的熒光染料，實現(xiàn)對多種蛋白質(zhì)的同時檢測。例如在多重免疫熒光實驗中，使用不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料標(biāo)記不同的抗體，一次實驗即可檢測多個目標(biāo)蛋白，通過不同顏色的熒光信號直觀展示各蛋白質(zhì)在細胞或組織中的定位和表達情況 。